Conceção de uma Desidrogenase de Álcool
Conceção racional de uma desidrogenase de um álcool modificada para álcoois C6 ou superiores.
CONTEXTO
A invenção/criação apresentada é o resultado de uma abordagem de engenharia de proteínas. Esta área de investigação facilitou a descoberta e a síntese de novas proteínas ou enzimas melhoradas com as propriedades desejadas, ultrapassando as limitações das enzimas nativas (por exemplo, baixa termoestabilidade e atividade enzimática). A conceção racional de proteínas é uma das estratégias abordadas pela engenharia de proteínas. Na nossa tecnologia, a AdhP de Escherichia coli foi modificada para produzir álcoois superiores, nomeadamente octanol. A adhP nativa é uma desidrogenase de um álcool (ADH), enzima dependente de NADH, sendo facilmente expressa em E. coli, e exibe uma elevada eficiência catalítica, nomeadamente na redução de pequenos aldeídos (acetaldeído e butanal). No entanto, aldeídos maiores que o butanal são pouco reduzidos, o que leva à necessidade de utilizar ferramentas racionais de engenharia proteica para melhorar os parâmetros cinéticos da AdhP em substratos grandes, especialmente o octanal. A existência de dados estruturais para a AdhP permite a utilização de técnicas de bioinformática estrutural para atingir este objetivo.
A análise e a comparação de várias álcool desidrogenases através de alinhamento estrutural e dados cinéticos são cruciais para caraterizar o centro catalítico, identificar os aminoácidos alvo e criar uma correlação entre as propriedades estruturais e a afinidade pelo substrato. Devido à existência de uma estrutura tridimensional da AdhP nativa, foi possível utilizar várias ferramentas computacionais estruturais que contribuíram para a conceção racional de uma enzima artificial com as características desejadas. As ADHs com maior afinidade para pequenos aldeídos (e.g., acetaldeído e butanal) têm resíduos de treonina e triptofano no centro catalítico, enquanto as ADHs com elevada afinidade para substratos volumosos têm aminoácidos mais pequenos nas mesmas posições.
Tendo isto em consideração, a caraterística distintiva da nossa tecnologia prende-se com a capacidade de gerar, a partir de enzimas pouco eficientes na redução do octanal e consequentemente na produção de octanol, o desenvolvimento de uma nova enzima com duas mutações, nomeadamente nos resíduos 39 e 84 (Thr39Ser e Trp84A). Esta enzima apresenta elevados níveis catalíticos para o octanal.
SOBRE A TECNOLOGIA
A existência da estrutura tridimensional e a utilização de diferentes ferramentas computacionais melhoram a engenharia de proteínas, permitindo estudar as propriedades individuais de uma molécula, bem como a interação entre o recetor e os ligandos, o que pode indicar mutações favoráveis e, consequentemente, gerar uma enzima a ser utilizada num bioprocesso eficaz, com novas funcionalidades e/ou elevados níveis catalíticos (Km, Kcat e Kcat/Km) e estabilidade.
Resumidamente, começámos por utilizar o software MODELLER para alinhar e comparar estruturas tridimensionais de múltiplas ADHs e foi também utilizado para construir, in silico, os mutantes da AdhP. O volume da bolsa de ligação ao substrato, para avaliar o impacto das mutações, foi determinado pela ferramenta trj_cavity. Além disso, foi efectuada uma docagem molecular para prever o modo de ligação produtivo dos aldeídos lineares no local de ligação do AdhP, bem como para avaliar o impacto das mutações através da energia de ligação.
Os alinhamentos estruturais múltiplos da enzima AdhP com álcool desidrogenases bem caracterizadas e identificaram 2 aminoácidos alvo (triptofano (Trp84) e treonina (Thr39)) no local ativo. Os resultados in silico, os cálculos do volume da bolsa de ligação ao substrato e as previsões de docagem molecular, demonstraram que a substituição destes aminoácidos por outros mais pequenos tem um efeito positivo. O alargamento da bolsa de ligação ao substrato provocado por mutações duplas melhorou a acomodação e o encaixe de substratos de grandes dimensões, permitindo que estes substratos assumissem posições de ligação produtivas com energias de ligação baixas. A caraterização in vitro foi efectuada com a adhP modificada e nativa. Foi efectuado um estudo cinético para vários aldeídos lineares e etanol. Além disso, a termoestabilidade do tipo selvagem e do mutante também foi avaliada usando diferentes técnicas, como fluorometria de varrimento diferencial e dicroísmo circular. Adicionalmente, foi efectuada a validação in vivo desta nova enzima. As experiências in vitro mostraram que o mutante Thr39Ser:Trp84Ala é 364 vezes mais eficiente cataliticamente na redução do octanal do que a enzima do tipo selvagem. O octanal é bem aceite como substrato, com o Km mais baixo, 0,08 mM, quando comparado com os outros aldeídos. A mutação implementada não afeta a termoestabilidade da proteína e exibe platôs de perfil de atividade máxima entre 25-30 ̊C. A nova enzima é também mais ativa entre pH 4-7,5, exibindo a atividade máxima a 7.
Desenvolvemos uma fábrica de células microbianas para produzir octanol através da engenharia da via de biossíntese de ácidos gordos para permitir a produção deste álcool a partir da glucose. A última etapa desta via é mediada por uma desidrogenase de um álcool. Os títulos de octanol obtidos pela AdhP modificada e pela AdhP de tipo selvagem foram comparados para validar a eficiência da enzima redesenhada. A estirpe com a AdhP modificada produziu cerca de 58 mg/L de octanol, enquanto a estirpe com a enzima nativa obteve 22 mg/L. Globalmente, os resultados obtidos provam que a AdhP modificada é muito eficaz, não só in vitro, mas também in vivo.
ESTÁGIO DE DESENVOLVIMENTO
Technology Readiness Level (TRL): 3 – Protótipo Laboratorial Desenvolvido.
BENEFÍCIOS E APLICAÇÕES
A utilização de álcoois superiores para substituir os combustíveis convencionais tem sido promovida de modo a minimizar os inconvenientes dos álcoois curtos (por exemplo, higroscopicidade, corrosividade, pressão de vapor). A AdhP é uma álcool desidrogenase, que catalisa a redução do aldeído no álcool correspondente. A enzima desenvolvida apresenta uma elevada especificidade e eficiência catalítica para o octanal, melhorando a sua redução e, consequentemente, os títulos de octanol. Para além disso, esta enzima é facilmente expressa em Escherichia coli, um cavalo de batalha industrial. Além disso, a enzima revela-se muito mais adaptável às gamas de pH e temperatura do que a proteína nativa, o que é uma caraterística valiosa para fins industriais.
Atualmente, o mercado do octanol pode ser segmentado em duas áreas diferentes: grau industrial e grau alimentar. Em 2015, aproximadamente 81% do mercado de octanol correspondia ao grau industrial. Num relatório da FiorMarkets, prevê-se que o mercado mundial de octanol atinja 243 milhões de euros em 2024, com uma taxa de crescimento anual composta (CAGR) de 4,7 %. Alguns destes mercados em crescimento para o octanol incluem o seguinte:
- Biocombustíveis- Devido às propriedades físico-químicas do octanol. A utilização de processos petroquímicos, nomeadamente o processo Zielger, para produzir uma corrente de álcool em que o octanol corresponde apenas a 17% do produto total. Assim, o aumento do comprimento da cadeia carbónica do álcool aumenta o poder calorífico e o índice de cetano, aproximando-se dos do gasóleo.
- Detergentes – O octanol é um produto industrial relevante, sendo comummente utilizado na produção de revestimentos, detergentes e tensioactivos, bem como em perfumaria/fragrâncias.
- Fabrico de plastificantes – O octanol é o precursor da síntese do octeno, um importante monómero para o polietileno linear de baixa densidade.
- Cosméticos e produtos de higiene pessoal: O octanol é também um ingrediente comum em cosméticos e produtos de higiene pessoal, tais como loções, cremes, champôs e amaciadores. É utilizado como solvente e emoliente, e ajuda a melhorar a textura e o aspeto da pele.
- Produtos químicos intermédios: O octanol é utilizado para produzir uma variedade de outros produtos químicos, tais como ésteres, éteres e polímeros. Estes produtos químicos têm uma vasta gama de aplicações, incluindo na produção de plásticos, têxteis e outros produtos.
- Solventes: O octanol é um solvente versátil que pode ser utilizado para dissolver uma variedade de materiais, incluindo óleos, gorduras e ceras. É utilizado no fabrico de tintas, vernizes e outros produtos.
- Aromas e fragrâncias: O octanol é utilizado como agente aromatizante em alguns alimentos e bebidas, como gelados, doces e perfumes. Tem um odor doce e frutado e pode ser utilizado para realçar os sabores de outros ingredientes.
- Produtos farmacêuticos: O octanol é utilizado na produção de alguns produtos farmacêuticos, como antibióticos e anti-inflamatórios. É também utilizado como solvente no fabrico de outros produtos farmacêuticos, como comprimidos e cápsulas.
PRIORIEDADE INTELECTUAL
- EP23154653.2 (Data de prioridade: 01/02/2023).
OPORTUNIDADE
- Disponível para licenças exclusivas e não exclusivas.
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NOVA Inventors
Cláudio Soares
Isabel Rocha
Diana Lousa
